简介
在生物医学检测领域，快速、准确且低成本的诊断方法一直是科研人员追求的目标。近日，一项关于纳米抗体（Nbs）的研究成果，为免疫诊断方法提供了全新思路。本文研究团队成功构建了双"Y"形纳米抗体组装体，并将其应用于侧向流免疫分析（LFIA），实现了对SARS-CoV-2 N蛋白500 pg/mL的高灵敏度检测。这一突破为纳米抗体在IVD领域的应用开辟了新路径，更有望解决传统检测技术面临的诸多痛点。
图1 双Y架构纳米抗体用于LFIA的示意图
一、纳米抗体的独特优势与应用局限
提起抗体，人们通常会想到由两条重链和两条轻链组成的传统抗体。但在骆驼科动物体内，存在一种特殊的"重链抗体"，其抗原结合片段——纳米抗体，是能结合抗原的最小片段。作为最小的天然抗体，纳米抗体具有三大核心优势：
自然界中结构最小的抗体：结构简单，仅由一个重链可变区组成，分子量约为15kDa，仅有传统抗体的1/10大小。这种小巧的结构使其能轻松穿透组织间隙，抵达传统抗体难以触及的抗原位点。
易于低成本高效表达：纳米抗体可在大肠杆菌等原核表达系统中高效表达，产量高且成本低，能大幅降低生产门槛。
稳定性出众：纳米抗体结构简单，且存在额外的二硫键让其在高温、极端pH等条件下仍保持活性，这对需要长期储存的诊断试剂而言至关重要。
这些特性使纳米抗体在IVD领域展现出巨大潜力。然而，当研究人员尝试将纳米抗体直接应用于LFIA时，却遇到了问题——因其分子量小，难以有效吸附在硝酸纤维素膜上，或吸附后易失去活性；且单域结构导致抗原结合位点单一，亲和力可能不足，影响检测灵敏度；在与纳米颗粒偶联时，还易出现聚集现象，影响试剂稳定性。
二、双 "Y" 架构：拼装纳米抗体
为克服这些局限，研究团队创新性地设计出双“Y”形纳米抗体组装体。该设计使用了SpyTag/SpyCatcher和Im7/CL7两个高效蛋白相互作用系统，以及一个四聚体螺旋结构，通过精准的分子工程手段，将纳米抗体组装成具有特定空间结构的多价复合物。
SpyTag/SpyCatcher 系统：SpyTag是含天冬氨酸的短肽，SpyCatcher是其结合伙伴，二者可通过天冬氨酸与赖氨酸之间形成的酰胺键共价连接，是高效的蛋白组装工具。
Im7/CL7系统：Im7（抑制剂免疫蛋白7）与CL7（大肠杆菌colicin E7 DNase的工程变体）具有超高亲和力（解离常数KD=10−14−10−17M），为组装体提供稳定结合力。
四聚体螺旋：作为结构支架，辅助形成对称的多价组装体，增加抗原结合位点数量。
具体而言，研究人员将两种抗SARS-CoV-2 N蛋白的纳米抗体（NAB1 和 NAB2）分别与SpyTag和Im7融合，同时将SpyCatcher和CL7与四聚体螺旋融合。当这些融合蛋白混合时，SpyTag与SpyCatcher形成共价键，Im7与CL7形成高亲和力非共价复合物，再加上四聚体螺旋的聚合作用，最终形成稳定的双“Y”形结构。
图2 基于SpyTag/SpyCatcher和Im7/CL7系统构建双Y结构纳米抗体
三、双“Y”形组装体的性能优势
这种双“Y”形组装体分子量比单体纳米抗体更大，增大了与硝酸纤维素膜的结合面积，提高了在LFIA检测线上的固定效率。表面等离子体共振实验显示，双“Y”形组装体与SARS-CoV-2 N蛋白的亲和力大幅提升。NAB1组装体亲和力提高5倍，NAB2组装体更是提高56倍。这种亲和力提升主要源于多价结合效应：组装体提供更多抗原结合位点，且解离速率显著降低，增强了与抗原的稳定结合。
图3双“Y”形组装体有更强的抗原亲和力
四、基于双“Y”形组装体的LFIA平台
基于双“Y”形组装体，研究团队开发了新型LFIA检测系统。他们将量子点标记的双“Y”形NAB1作为捕获抗体固定在结合垫上，双“Y”形NAB2固定在检测线上，同时设计了一种突变的N蛋白（N₂）作为质控线。样本中存在SARS-CoV-2 N蛋白时，形成的“捕获抗体-抗原-检测抗体”三明治结构，在紫外光下产生荧光信号。
图4基于量子点和双“Y”形组装体的LFIA系统示意图
五、新型LFIA平台的性能验证
在LFIA应用中，双“Y”形组装体表现出优异性能。研究团队将量子点标记的双“Y”形NAB1作为捕获抗体，双“Y”形NAB2作为检测抗体，构建了检测SARS-CoV-2 N蛋白的LFIA系统。该系统检测限达500 pg/mL，与商用单克隆抗体试剂盒相当，且对其他6 种冠状病毒的N蛋白无交叉反应，特异性良好。
图5 基于量子点和双“Y”形组装体LFIA系统的灵敏度
六、总结与展望
本文开发了一种双“Y”形纳米抗体组装体，为LFIA技术发展开辟了新路径。它保留了纳米抗体低成本、易于表达的优势，又通过分子组装克服了其在LFIA中的固有缺陷，实现了与传统单克隆抗体相当的检测性能。这一技术不仅可应用于新冠病毒检测，还可推广至其他病原体、肿瘤标志物、食品安全污染物等的检测，为开发更多高灵敏度、低成本的快速诊断试剂提供了通用平台。未来，随着技术不断优化，相信基于纳米抗体组装体的LFIA技术将在临床诊断、环境监测、食品安全等领域发挥重要作用，为疾病防控和公共卫生保障贡献力量。
参考文献
[1]Xiao Y, Dong H, Wu C, et al. Nanobody in a Double "Y"-Shaped Assembly: A Promising Candidate for Lateral Flow Immunoassays. Anal Chem. 2024;96(18):7130-7137. doi:10.1021/acs.analchem.4c00509
