摘要：
肿瘤的早期诊断至关重要，可以提升治疗的成功率和患者的存活率。无创液体活检技术有望通过检测体液标志物以发现和监测肿瘤的动态变化，然而目前该技术的应用受到检测方法敏感性和特异性不足等因素的限制。细胞游离DNA（cfDNA）是由细胞释放至血液中的降解DNA片段，其中包含少量循环肿瘤 DNA（ctDNA），因此血液中ctDNA的检测作为非侵入性的癌症诊断和疾病监测方法极具前景。然而，循环中的cfDNA丰度低，且清除速度快，使得本就含量稀少的ctDNA的检测难上加难。这主要归因于两个方面：一是循环核酸酶的降解作用；二是肝脏的清除作用。在本文中，研究团队便针对这两条途径提出了降低cfDNA在血液中的清除速率的策略，旨在提高液体活检对ctDNA检测的灵敏度。在此过程中，研究团队通过Rapid Novor（快序生物）的REmAb蛋白从头测序技术获得并改造了抗体序列（图1）。这一研究有望为癌症患者的护理和治疗提供新的有力工具。
图1 基于蛋白从头测序改造抗体用于改善ctDNA的液体诊断方法
结果
抗体预处理剂保护cfDNA免受核酸酶清除
为了探究能否通过抗体来减缓体内cfDNA的清除，研究团队选择了对dsDNA和单链DNA（ssDNA）均有较好结合能力（Kd分别为90和700 nM）的小鼠单抗35I9进行研究。在体外实验中，35I9可以与游离/组蛋白结合的dsDNA形成复合物，并且保护dsDNA免受DNase I的清除（图2 A B）。在体内实验中，研究团队对小鼠注射了携带特定DNA序列的单核小体（W601），虽然35I9可以延缓血清中W601的清除，但在注射60分钟后W601的绝对量仍较低（图2 C D）。研究团队推测这种现象是因为FcγR介导的对dsDNA-35I9复合物的清除作用。为验证这一推测，他们同时注射了FcγR抗体，观察到W601的含量显著增加（图2 C）。
为了消除抗体与FcγR的结合，研究团队运用Rapid Novor（快序生物）的REmAb单克隆抗体从头测序技术，解析了35I9单抗的全长氨基酸序列，并对其Fc区域进行突变。其中aST3突变在体内实验中对W601的保护作用最强，因而被用于后续研究（图2 D）。体内药代动力学研究显示，aST3相较于35I9，在血浆中清除速度更慢（图2 E），在脾脏中分布更少（图2 F）。综上所述，这种Fc区域突变的抗体在体循环中能够保护cfDNA免受核酸酶清除，增加血浆中回收的cfDNA量。
图2 抗体预处理剂结合cfDNA并减缓其在健康小鼠中的清除
抗体预处理剂改善肿瘤液体活检效果
接下来研究团队进一步探究改造后的抗体aST3是否能够改善肿瘤的液体活检效果。团队建立了Luc-MC26细胞肺转移肿瘤小鼠模型，在造模第2周单次注射不同剂量的aST3抗体，2小时后抽血检测cfDNA和ctDNA（图3 A）。结果表明，aST3可以显著提升血浆中回收的cfDNA（图3 B），增加检测到的突变分子量（图3 C），且不影响cfDNA中肿瘤DNA占比（图3 D）。注射aST3后可以检测到更多ctDNA单核苷酸变异（SNVs）（图3 E），对ctDNA的检测灵敏度更高（图3 F G）。
图3 抗体在小鼠肺转移肿瘤模型中提高cfDNA的回收量
纳米颗粒预处理剂改善肿瘤液体活检效果
除了被循环的核酸酶降解外，cfDNA的另一条主要体内清除途径是被肝脏驻留的单核吞噬细胞（如Kupffer细胞）吞噬。体内大部分的cfDNA是以单核小体的形式与组蛋白结合成纳米颗粒。因此研究团队提出假设，使用竞争性的纳米颗粒（例如脂质体）能够暂时饱和这些细胞的吞噬能力，从而减少cfDNA的清除。研究团队在体内外水平证实了这一假设，纳米颗粒能够减少cfDNA的清除，增加它在血中的浓度，提高对微小肿瘤的检测灵敏度。
综上所述，本研究基于体内cfDNA的两条主要清除路径，分别设计了抗体和纳米颗粒预处理剂，将血液中ctDNA的回收量提高了10倍以上，显著提升了肿瘤检测灵敏度（图4）。
图4 预处理剂减少cfDNA的体内清除并提高液体活检的灵敏度
关键点：
ctDNA作为血液中的肿瘤标志物，在非侵入性癌症检测和监测方面展现出了良好的应用前景，但其检测的有效性受到cfDNA体内降解和清除机制的限制。
本研究提出了一种采用无FcγR结合能力的DNA结合单抗，保护cfDNA免受核酸酶降解，从而增加血液中ctDNA回收量的方法。
本研究采用Rapid Novor（快序生物）的REmAb蛋白从头测序技术获得了目的抗体序列，并在此基础上对Fc区域进行改造，获得无FcγR结合能力的DNA结合单抗aST3。
aST3使荷瘤小鼠血液中的ctDNA回收量提高了10倍以上，增强了肿瘤液体活检的灵敏度。
参考资料
1. Martin-Alonso C, Tabrizi S, Xiong K, Blewett T, Sridhar S, Crnjac A, Patel S, An Z, Bekdemir A, Shea D, Wang ST, Rodriguez-Aponte S, Naranjo CA, Rhoades J, Kirkpatrick JD, Fleming HE, Amini AP, Golub TR, Love JC, Bhatia SN, Adalsteinsson VA. Priming agents transiently reduce the clearance of cell-free DNA to improve liquid biopsies. Science. 2024 Jan 19;383(6680):eadf2341. doi: 10.1126/science.adf2341.
2. https://www.rapidnovor.com/priming-agents-cell-free-dna/
