如何高效便捷地找到安全且有效的抗体？你可能考虑过杂交瘤，噬菌体，甚至单B细胞测序。但是，你肯定没有想到有朝一日可以从人和动物的血清多抗中通过直接蛋白测序获得抗体序列。
血清多抗，作为蕴含高亲和力抗体的宝贵资源，在生物医药研发、科学研究等众多领域内扮演着不可或缺的角色。然而多抗的生产依赖于动物，这不可避免地导致了其可重复性低、批次间差异大等局限性，从而限制了其广泛应用。因此，精准鉴定血清多抗中的抗体序列，复现原始多抗的优异性能，是抗体试剂领域研究人员一直希望实现的目标。
基于质谱的蛋白质从头测序技术，在单抗的研究中已取得显著进展并获得了广泛应用。然而，在应对血清多抗的高度复杂性时，该技术的应用仍面临着诸多挑战。尽管已有研究投入了大量努力，试图开发从人血清多抗中有效筛选和鉴定抗体的方法，但迄今为止，这些研究尚未能突破技术瓶颈，实现预期的成功。
Rapid Novor（快序生物）是蛋白从头测序技术的全球领跑者。2024年10月10日，Rapid Novor的研究团队在Nature Communications期刊发表了题为：De novo protein sequencing of antibodies for identification of neutralizing antibodies in human plasma post SARS-CoV-2 vaccination的研究论文[1]。
该研究开发了一种融合传统蛋白质组学和从头测序技术的创新性方法，成功从接种SARS-CoV-2疫苗的人类血清多抗中精准鉴定到了一系列中和抗体，尤为值得一提的是，其中大部分是通过传统的B细胞测序技术无法获得的抗体序列。这一成果不仅展示了这种新方法从复杂的血清多抗中高效筛选抗体的可行性和巨大潜力，也是国际上首次发表对一个复杂蛋白体系的成功测序，具有重要的科学价值。
抗体作为高度特异性的分子，对生物治疗和诊断检测领域具有极大吸引力。而传统的抗体筛选方法存在诸多问题，限制了其广泛应用：比如杂交瘤筛选周期长，得到的抗体需要人源化；而噬菌体展示技术流程复杂、筛选片段长度有限等。
单B细胞测序技术是近年来比较流行的抗体发现策略，它利用每个B细胞只产生一种特异性抗体的特性，通过对免疫动物的B细胞进行单细胞测序，可以高通量获得天然轻重链配对的抗体序列。这看起来是一项很完美的技术，但仍存在一些不足之处。最重要的一点是，虽然B细胞测序可以有效发现抗体，但在血液中分泌抗体的浆细胞极少，且存活时间短，因此对外周B细胞的研究无法捕捉外周抗体的全部多样性。
与此相反，各个器官的B细胞产生的多克隆抗体pAbs（特别是IgG）在血液循环中含量丰富，且半衰期长。根据研究估算，通过外周血单B细胞测序发现的抗体可能只有约2%与循环IgG匹配。此外，血清中循环的抗体经过了免疫系统和血液系统的双重筛选，其安全性和有效性更有保障。因此，从血清中直接富集多抗进行从头测序，是获得优质治疗性抗体的有效途径。
在这项最新研究中，研究团队巧妙地融合了多种分析技术，建立了血清多抗的测序流程。这些技术涵盖了蛋白分离、非还原条件下蛋白消化、从头测序（de novo sequencing）、自下而上（bottom-up）蛋白组学、多肽化学、w离子测定、自中而下（middle-down）蛋白组学、非标记定量蛋白组学、重链-轻链配对等。通过这一系列精心设计的步骤，研究团队成功实现了降低样本的复杂度、从头测序获得肽段序列、正确区分亮氨酸/异亮氨酸同分异构体、正确拼接包括CDR区域的全长抗体单链、正确配对抗体的轻重链，最终从血清多抗中鉴定出准确的抗体序列。
在成功构建这套测序技术流程后，研究团队首先对来自三名疫苗接种者的血浆样本中的抗体进行了评估，选择了对SARS-CoV-2受体结合域（RBD）展示出最优亲和力的接种者抗体进行测序，共获得了12个抗体序列。
进一步分析结果显示，在所发现的这些抗体序列中，有6个抗体序列对RBD的亲和力与原始多抗相当（PD124），而且它们在血管紧张素转换酶 2（ACE2）竞争结合实验和假病毒中和实验中均展现出对SARS-CoV-2的中和能力。
尤为值得一提的是，在这6个抗体序列中，有4个（R5, R6, R11, R12）是完全通过从头测序技术独立获得的，彰显了使用该技术流程高效、精准地从复杂的血清多抗中鉴定出高活性抗体序列的卓越能力。
综上所述，本研究成功克服了多抗测序的诸多困难，建立起一套切实可行的技术方案，实现了人血清多抗的从头测序，并且通过实例证明了这一方案可以发现与原始多抗活性相似的抗体序列。这一研究不仅凸显了多抗从头测序技术的独特价值，还展示了该技术用于探索单B细胞测序技术无法触及领域的广阔应用前景，比如深入理解动物和人体复杂的免疫应答机制。
本文的第一作者，Rapid Novor（快序生物）公司负责多抗测序项目（REpAb）的首席科学家Thierry Le Bihan博士表示：“我们的技术将从头测序与蛋白质组学相结合，因此能够发现更多样的抗体。我们发现的一些抗体可能在免疫系统中发挥关键作用，但在传统的分析策略中往往被忽视。蛋白从头测序在全面、深入挖掘抗体资源方面显示出非凡的潜力，而未来方法学的发展将推动该领域取得更大进步。”至今Rapid Novor（快序生物）团队已经成功完成了超过100个多抗测序项目，并保持了100%的成功率。他们正在积极携手全球TOP制药公司和生物技术公司，将REpAb技术整合至高价值抗体开发的关键工作流程中。
Rapid Novor（快序生物）董事长兼首席科学家马斌博士为论文通讯作者。马斌博士是加拿大滑铁卢大学计算机系教授，是基于质谱对蛋白质进行从头测序（de novo sequencing）领域的主要奠基人之一。他先后主导了该领域的第一代和第二代从头测序算法的开发，完成了抗体蛋白从头测序技术从0到1的突破。此次他带领研究团队首次报道了从接种SARS-CoV-2疫苗的人类血清多抗中直接测得中和抗体，标志着Rapid Novor（快序生物）在蛋白从头测序技术领域的绝对领导地位。
Rapid Novor（快序生物）目前在中国提供基于血清多抗直接测序的抗体发现服务，如需了解更多详情，敬请关注公众号与我们联系。
参考文献
[1] Le Bihan T, Nunez de Villavicencio Diaz T, Reitzel C, Lange V, Park M, Beadle E, Wu L, Jovic M, Dubois RM, Couzens AL, Duan J, Han X, Liu Q, Ma B. De novo protein sequencing of antibodies for identification of neutralizing antibodies in human plasma post SARS-CoV-2 vaccination. Nat Commun. 2024 Oct 10;15(1):8790. doi: 10.1038/s41467-024-53105-8. PMID: 39389968.
