在全球老龄化加剧的当下，阿尔茨海默病（AD）已成为严重威胁公众健康的“隐形杀手”。据相关数据显示，AD发病率正逐年攀升，给家庭和社会带来了沉重负担。随着首款疾病修饰疗法的问世，在AD临床症状出现前进行早期诊断变得至关重要，这也是当下科研领域的关键攻坚点，而寻找高效、精准的AD生物标志物，更是这一领域的核心研究方向。得益于超灵敏检测技术的飞速发展，可测量的人体体液蛋白质浓度范围得以扩大，为AD生物标志物的研究开辟了新的道路。其中，不同形式的磷酸化tau蛋白（p-tau）在脑脊液（CSF）和血浆中作为AD生物标志物展现出巨大潜力。本文研究团队基于单分子免疫阵列（Simoa）技术，开发了检测特定双位点p-tau的免疫分析方法，并描述了AD患者CSF和血浆中p-tau的变化，为AD诊断提供了新视角。
主要研究结果
双位点p-tau诊断方法的设计
tau蛋白存在超过50个磷酸化位点，以往的研究中多对单点p-tau进行检测。为深入探究多位点p-tau蛋白作为AD生物标志物的潜力，研究人员开发了两种基于Simoa技术的夹心免疫测定法（图 1）。一种可检测T181和T231位点同时磷酸化的tau蛋白（p-tau181&231），另一种检测T217和T231位点同时磷酸化的tau蛋白（p-tau217&231）。Simoa技术的核心原理是利用纳米级的微孔，将单个免疫复合物分隔开来进行检测，极大地提高了检测的灵敏度。本研究在磁珠上包被某一个磷酸化位点的抗体作为捕获抗体，例如图1 a包被了p-tau231抗体。当样本加入后，若样本中存在p-tau181&231，会与捕获抗体特异性结合。接着加入生物素标记的第二个位点抗体作为检测抗体，例如图1 a使用的p-tau181抗体。最后，加入链霉亲和素标记的β-半乳糖苷酶（SBG），其与免疫复合物结合并催化β-D-半乳糖吡喃糖苷（RGP）底物产生荧光，从而实现双位点磷酸化tau蛋白的精准检测。两个方法的定量下限分别达到1.25 pg/mL（p-tau181&231）和0.05 pg/mL（p-tau217&231）。
脑脊液与血浆中不同位点p-tau间的相关性
在对所开发方法进行技术验证后，研究人员对两个队列（发现队列n=55，验证队列n=118）的脑脊液和血浆样本进行检测，这些样本来自不同临床阶段的AD患者、额颞叶痴呆（FTD）患者以及神经系统疾病对照组（NDC）。
在发现队列中评估发现，血浆p-tau181&231与脑脊液及血浆中的p-tau181、p-tau231均无相关性，与脑脊液中的对应物（脑脊液p-tau181&231）同样无关联（图 2a）。相反，脑脊液和血浆中的p-tau217&231与脑脊液和血浆中的p-tau217及p-tau231水平均呈现出强正相关（图 2a、b）。这一结果表明，p-tau217&231在不同体液间的关联更为紧密，暗示其在反映疾病状态方面可能具有独特的作用。在验证队列中，这一相关性趋势得到了进一步的证实，为后续研究双位点磷酸化tau蛋白的诊断价值提供了重要依据。
图2 脑脊液和血浆中不同位点p-tau的相关性
发现队列中不同位点p-tau的诊断效能
对不同位点p-tau的诊断效能评估发现了巨大差异。在脑脊液中的p-tau181&231和p-tau217&231在区分AD患者和对照组时表现优异（图3 a）。血浆p-tau181&231无此区分效能，而血浆p-tau217&231却表现优异，其诊断准确性甚至超过了单一位点磷酸化的p-tau217和p-tau231，凸显了其在AD诊断中的优势（图3 b）。
图3 发现队列中脑脊液和血浆不同位点p-tau的诊断效能
验证队列中不同位点p-tau的诊断效能
验证队列的结果进一步支持了发现队列的结论。脑脊液中的p-tau181、p-tau231和p-tau181&231能很好区分NDC（对照组）与AD各阶段患者（图4 a）。此外，在区分AD-dem（AD 痴呆阶段）与FTD（额颞叶痴呆）患者方面也有较好的表现。p-tau217&231同样展现出了类似的良好诊断性能。与发现队列结果一致，血浆p-tau217&231也能很好地区分AD患者与FTD和NDC，表明其作为CSF和血浆标志物均能精确诊断AD患者（图4 b）。受试者工作特征曲线（ROC）分析表明，在发现队列和验证队列中，血浆p-tau217&231诊断不同阶段AD患者的能力优于p-tau217和p-tau231，提示这种双点p-tau在AD诊断中的独特价值（图5）。
图 4 验证队列中脑脊液和血浆不同位点p-tau的诊断效能
图5血浆中p-tau217、p-tau231和p-tau217&231的ROC分析
双位点磷酸化tau蛋白对AD诊断的意义
tau蛋白磷酸化会影响微管结合，进而干扰轴突生长和轴突运输，这些过程在AD患者中往往受到损害。研究表明CSF和血浆多个位点的p-tau（例如181,217,231）可用于AD诊断。然而，tau蛋白磷酸化模式在AD进程中的复杂性超乎想象，存在超过50个磷酸化位点，不同位点的磷酸化的作用也尚未完全明确，它们在大脑和不同体液中的关系也有待进一步挖掘。此次研究中开发的两种检测方法，从技术层面实现了对双位点磷酸化tau蛋白的精准检测。在实际临床应用方面，它们展现出良好的潜力，尤其是p-tau217&231，无论是在脑脊液还是血浆中，都表现出作为AD生物标志物的优势。这一发现为AD的早期诊断提供了新的思路和方法，有助于更准确地评估疾病状态和监测疾病进展。
关注点：
[1]高灵敏度的Simoa技术非常适合检测血液样本中的低丰度生物标志物，例如p-tau，用于神经退行性疾病的早期诊断。而这些方法的建立需要性能优异的抗体试剂，这对抗体发现技术提出了更高要求。
[2]tau蛋白存在超50个磷酸化位点，未来其他多位点p-tau对AD的诊断、治疗意义仍有待研究。因此可以预计，未来用于AD诊断的生物标志物和检测方法将更加多样化。
[3]Rapid Novor快序生物能提供全球唯一基于血清多抗测序的抗体发现服务，可以高效发现优质天然抗体，复现原始多抗优异性能，助力AD诊断方法的开发。
参考文献：
[1]Wojdała AL, Bellomo G, Gaetani L, Teunissen CE, Parnetti L, Chiasserini D. Immunoassay detection of multiphosphorylated tau proteoforms as cerebrospinal fluid and plasma Alzheimer's disease biomarkers. Nat Commun. 2025 Jan 2;16(1):214. doi: 10.1038/s41467-024-54878-8.
