引言
纳米抗体，是只含有VHH（重链抗体可变区）结构域的单域抗体，来源于骆驼科等动物仅由重链组成的重链抗体。纳米抗体的体积较小，却保留了与常规抗体相似的抗原结合能力。这些特征使其在组织穿透性、稳定性和溶解性等方面具有独特优势，特别适用于某些治疗和诊断领域。因此，了解纳米抗体的准确序列，将有助于理解其构效关系，为诊断工具和治疗药物的研发提供关键信息，推动纳米抗体在生物医学领域的应用。
纳米抗体的结构
纳米抗体仅由一条约含110个氨基酸的多肽链构成，分子量约为15 kDa（图1）。它包含了结合抗原并引发与传统抗体相似反应所需的所有功能域。纳米抗体与常规抗体的VH（重链可变区）结构域在结构特征方面既有许多相似之处，也存在诸多不同（图2）。
图1 常规IgG抗体、骆驼科动物抗体和纳米抗体之间的结构差异
相似之处：
框架区：由四个保守的骨架区（FR）组成。
互补决定区：具有互补决定区（CDR1-3），这些区域高度可变，负责与抗原结合。
折叠方式：其FR和CDR会折叠成两个β折叠片层，其中一个由四条β链组成，另一个由五条β链组成。CDR位于β链之间，形成抗原结合位点。
不同之处：
结构复杂性：纳米抗体是单体形式，仅有三个CDR，而常规抗体的VH有六个CDR。
抗原结合能力：纳米抗体由于结构复杂性降低，使其CDR1环扩大，CDR3环延伸，这有助于增加纳米抗体在抗原结合方面的多样性（图2）。
二硫键：常规抗体的VH含有许多二硫键，将其与轻链可变区（VL）相连。纳米抗体VHH通常仅含有一个二硫键，有助于它的结构稳定性。
氨基酸组成：常规抗体的VH和VL之间需要相互作用，其FR2含有保守的疏水性氨基酸残基。对于纳米抗体而言，FR2由亲水性氨基酸残基组成。
互补位形状：由于纳米抗体的CDR3环得以延伸，所以它们呈现出凸形的互补位形状，而常规抗体VH - VL的互补位则是凹形或扁平的。
图2 常规IgG抗体VH结构域与骆驼科动物抗体VHH结构域之间的结构差异
基于从头测序的抗体发现技术获得并重组表达纳米抗体
Rapid Novor（快序生物）独有的基于质谱蛋白从头测序技术的抗体发现路径，可以对血清抗体直接测序，发现经血液和免疫系统筛选的优质纳米抗体，具体流程如下（图3）。
1. 免疫：使用目标抗原对骆驼或羊驼进行免疫，引发免疫反应，产生识别抗原的抗体。
2. 提取与筛选：从免疫过的骆驼科动物身上提取血液，并使用抗原亲和纯化法对血清进行纯化，获得针对目标抗原的重链抗体。
3. 酶解：将分离出的重链抗体用多种酶进行酶解，使其成为肽段。
4. 测序：利用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）和从头测序技术对肽段进行测序。借助基于机器学习（ML）的生物信息学方法，将测序获得的肽段序列拼接成完整的抗体序列。
5. 重组生产：将纳米抗体序列插入表达载体，并转染到选定的宿主细胞中。经过细胞扩增后，便可生产出所需的纳米抗体。
6. 纯化与质量分析：经过不同的纯化步骤，如亲和色谱法，去除杂质并分离出所需的纳米抗体。随后通过SDS-PAGE、ELISA、质谱测序等方法，对获得的纳米抗体进行质量分析。
图3 REpAb抗体发现技术用于纳米抗体的开发应用
纳米抗体的应用
纳米抗体自被发现以来，便作为极有价值的工具，在诊断、治疗和研究等领域有着广泛应用。
1. 诊断应用
纳米抗体由于具有更高的亲和力与稳定性、更多样的互补位库以及不与宿主抗体发生交叉反应等优点，非常适合用于免疫测定。例如，纳米抗体已被证明，比常规抗体更适用于寄生虫的检测。纳米抗体能比常规抗体更深入地穿透组织，且肾脏清除速度更快，因此也极适用于开发正电子发射型计算机断层显像（PET）等诊断成像方法。近期研究表明，与常规抗体相比，纳米抗体有更优的PET成像效果，且对非靶器官的辐射更少，进一步凸显了纳米抗体在科研和医学诊断领域的优势。
2. 治疗应用
纳米抗体凭借其高特异性、亲和力、溶解性、热稳定性以及组织和细胞穿透性等特性，成为治疗药物的极佳候选分子。此外，与常规抗体治疗药物相比，纳米抗体还具有低聚集性、低免疫原性和较短的血清半衰期，可以被设计用来靶向几乎任何致病的分子靶点。
癌症治疗：纳米抗体因为能较轻松地穿透肿瘤，并且可以靶向癌症特异性靶点，在癌症治疗领域尤其具有优势。例如，在2022年，美国FDA批准了表达纳米抗体的CAR T疗法，用于治疗多发性骨髓瘤。
自身免疫性疾病治疗：纳米抗体给自身免疫性疾病的治疗带来了重大变革。例如，在2019年，美国FDA批准了一种纳米抗体治疗药物，用于治疗一种罕见的凝血障碍疾病。此外，研究表明针对TNF-α受体的纳米抗体能够通过将治疗药物特异性地递送至炎症组织，提高类风湿性关节炎和炎症性肠病（IBD）治疗的安全性和有效性。
传染病：研究人员发现，与常规抗体疗法相比，纳米抗体具有更好的病毒中和能力。纳米抗体能够靶向常规抗体无法触及的特定隐蔽表位，从而更加有效。例如，针对SARS-CoV-2开发的纳米抗体在靶向特定隐蔽表位方面已展现出良好前景。此外，纳米抗体不太容易出现“疫苗逃逸”和“突变逃逸”现象，这使得它们在应对新冠疫情时更加高效。尽管要将纳米抗体治疗药物推向市场还需要更多的研究，但它们的潜力极为广阔。
从头测序技术推动纳米抗体开发应用
纳米抗体作为生物技术领域的革新力量，为医学诊断和治疗开辟出全新的可能。然而要充分发挥其潜力，就必须了解其精准的氨基酸序列，以此开发和优化纳米抗体的应用。
Rapid Novor（快序生物）是蛋白从头测序技术的领跑者，通过全球顶尖的从头测序算法，可以无需借助任何数据库，直接对抗体测序，获得全长精准氨基酸序列。
Rapid Novor（快序生物）的抗体发现技术可以直接从免疫动物的血清多抗中鉴定出优质抗体序列，从而加快纳米抗体药物的开发进程，最终推动它们进入市场。如需了解更多抗体测序服务的信息，请通过公众号与我们联系。
参考资料
https://www.rapidnovor.com/nanobody-sequencing/
