整合素是由不同α亚基和β亚基组成的异二聚体，它们通过整合细胞内外环境来发挥诸多生理作用，例如介导细胞黏附、迁移和组织形成。整合素的胞外结构域能与其他细胞表面的配体结合，而其胞质结构域则与细胞骨架相关的衔接蛋白结合。在配体结合后，整合素会处于伸展开放状态，使拉力能够稳定整合素与细胞骨架成分之间的结合。
迄今为止，仅对RGD（含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列配体）结合类整合素（如αvβ3）进行了单分子水平的力学研究。研究表明，结合RGD的整合素使细胞铺展所需的张力阈值超过约40pN。本研究团队对不同整合素亚型展开研究，发现与RGD结合类整合素相比，整合素α4β1亚型激活细胞铺展所需的张力阈值明显更低，揭示了不同整合素亚型发挥生物学效应的力学特征存在差异。
本研究中团队使用了Rapid Novor（快序生物）的REmAb蛋白从头测序技术获得了αv整合素的抗体13C2的全长氨基酸序列，将其重组表达后构建了分子探针，成功用于活细胞成像和免疫染色（图1）。
图1 抗体测序助力构建用于细胞成像的荧光探针
相关结果
抗体测序用于构建荧光标记Fab分子探针
为了在细胞水平对整合素进行标记与成像，研究团队将β1E（伸展构象）、β1EO（活化构象）、α4、αv整合素对应的抗体使用papain酶切成Fab片段，然后使用荧光染料Alexa Fluor 488或Alexa Fluor 647 NHS Ester标记。其中αv整合素的抗体13C2序列由Rapid Novor（快序生物）的REmAb蛋白从头测序技术获得。接下来，将人成纤维细胞BJ-5ta接种在带有RGD-54pN（结合RGD的整合素的配体）或LDVP-54pN（整合素α4β1的配体）张力计量器的玻片表面，测量了这些标记后的Fab与细胞的结合和解离速率（图2 a-d）。结果表明，这些标记后的Fab可以满足实时细胞成像的需求（图2 e）。
图2 荧光标记Fab与细胞表面整合素的结合动力学研究
荧光探针检测整合素的空间分布和构象状态
在成功构建和测试了这些标记Fab分子探针后，研究团队借助它们对细胞粘附结构进行成像研究。在细胞与RGD-54pN接触的表面上，整合素αV成簇分布于细胞边缘附近。αV在细胞边缘和细胞腹侧应力纤维的末端，与细胞骨架中的肌动蛋白束相连，形成了粘附斑（图3 a）。在细胞与LDVP-54pN接触的表面上，整合素α4并没有形成类似的簇状分布，而是形成分散的小簇。同时，也未观察到明显的腹侧应力纤维（图3 b）。整合素αV和α4在两个表面上的分布均不重合（图3 c）。桩蛋白作为一种细胞骨架衔接蛋白，在两个表面上整合素αV和α4黏着斑中均有分布（图3 d）。利用这些标记Fab，还能实现对低亲和力闭合状态（C、BC和EC）和高亲和力开放状态（EO）的β1整合素在细胞表面的空间分布进行测定（图3 e f）。结果表明细胞腹侧表面只有一部分αVβ1和α4β1整合素被激活，并且分布于黏着结构。
图3 荧光标记Fab显示整合素介导的细胞粘附结构
关键要点：
l 研究团队应用了各种技术在单分子水平对不同整合素亚型激活细胞铺展所施加的力进行了分析。
l 研究团队使用Rapid Novor（快序生物）的REmAb蛋白从头测序技术获得了整合素αV抗体13C2的全长精准氨基酸序列，通过重组表达合成带有荧光标记的13C2 Fab，用于细胞表面整合素的成像分析。
参考资料：
[1] Jo MH, Li J, Jaumouillé V, Hao Y, Coppola J, Yan J, Waterman CM, Springer TA, Ha T. Single-molecule characterization of subtype-specific β1 integrin mechanics. Nat Commun. 2022 Dec 3;13(1):7471. doi: 10.1038/s41467-022-35173-w.
[2] https://www.rapidnovor.com/single-molecule-characterization-of-subtype-specific-integrin-mechanics/
